Ciclo I - Módulo II - Bioquimica (Enzimas)

Enzimas

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A manutenção da vida celular depende da contínua ocorrência de um conjunto de reações químicas, que devem atender a duas exigências fundamentais:
Ser altamente específicas.
Devem ocorrer a velocidades adequadas à fisiologia celular.



As enzimas são catalizadores protéicos que aumentam a velocidade de uma reação química e não são consumidos durante a reação que catalisam. Propriedades: sítio ativo, eficiência catalítica, especificidade, co-fatores, regulação, localização dentro da célula.

Uma enzima permite que a reação proceda rapidamente em condições existentes dentro da célula, por facilitar uma via alternativa de reação com uma menor energia de ativação.

Características:

Condição da enzima

O substrato tem que ligar na enzima porque senão não forma produto.

As enzimas transformam uma substância química em outra(s) substância(s) química(s).

Conceito: transformam reajentes (substâncias químicas) em outra ou outras substâncias químicas (produtos).

substrato: é o reajente que é transformado pela enzima

A redução da energia de ativação pode ser obtida pela presença de catalisadores.

Os catalisadores são substâncias que aceleram a velocidade de uma reação, sem alterar a proporção entre reagentes e produtos encontrada no final da reação e sem serem efetivamente consumidos durante o processo.

Todas as células dispõem de proteínas capazes de exercer função catalítica: são as enzimas.

A eficiência da catálise enzimática deriva da ligação do reagente (substrato) à enzima.


São dividas em 6 classes
Nomenclatura das enzimas: tipo da reação catalizada mais o sufixo ase (ASE). Por exemplo:
Liase - adiciona o grupo
Transferase - faz transferência
Isomerase - isomerização
Ligase - faz ligação
Oxidorredutase
Hidrolase

Cada enzima é específica para o seu substrato

O substrato tem 3 carbonos (triose) e a enzima isomerisa (isomeerose). Por isso, é uma triose isomerose.


Como funcionam as enzimas?

As enzimas aceleram a velocidade da reação por diminuir sua energia de ativação.

O que é a energia de ativação?
É a quantidade de energia necessária para levar todas as moléculas de 1 mol de uma substância até o estado de transição. É a barreira que separa os reagentes dos produtos.

Mas o que é estado de transição?
Quando a colisão entre as moléculas leva a adquirir uma quantidade mínima de energia que lhes permita atingir um estado reativo.

Reajente tem que dar produto. Usa energia de ativação necessária para gerar produto.

As moléculas são ativadas para formar o produto.

A enzima aumenta a velocidade da reação.

Por que a enzima é capaz de aumentar a velocidade da reação? Porque ela diminui a energia de ativação. A velocidade é muito maior do que sem a enzima.

Todo catalizador reduz a energia de ativação mas, a enzima reduz mais. Exemplo:

A enzima posiciona o reagente (substrato) corretamente.

O substrato é o reagente que a enzima atua para a formação do produto. O substrato se liga na enzima.

Centro ativo da enzima é um local na superfície da enzima, onde o substrato deve se ligar.

Propriedades das Enzimas

As enzimas são catalisadores protéicos que aumentam a velocidade de uma reação química e não são consumidos durante a reação que catalisam.

- Sítios ativos: as moléculas de enzimas contém uma região específica formando uma fenda ou bolso, que é chamada de sitio ativo. O sítio ativo contém cadeias laterais de aminoácidos, as quais criam uma superfície tridimensional complementar ao substrato. O sítio ativo liga o substrato, formando um complexo enzima-substrato (ES). O complexo ES é convertido em enzima-produto (EP), oqual subsequentemente se dissocia em enzima e produto.

- Eficiência catalítica: as reações catalisadas por enzimas são, em sua maioria, altamente eficientes. Tipicamente, cada molécula de enzima é capaz de transformar de 100 a 1000 moléculas de substrato em produto por segundo. O número de moléculas de substrato convertidas em moléculas de produto por molécula de enzima por segundo é chamado de número de renovação.

- Especificidade: as enzimas são altamente específicas, interagindo com um ou alguns pucos substratos e catalisando apenas um tipo de reação química.

Se uma enzima atua sobre um único substrato --> especificidade absoluta. Ex: amilose e sacarose

Se uma enzima atua sobre mais de um substrato (moléculas altamente semelhantes) -->; especificidade relativa. Ex: glicose e frutose.

- Co-fatores: algumas enzimas se associam com um co-fator não-protéico, o qual é necessário para a atividade enzimática. Os co-fatores comumente encontrados incluem íons metálicos ou moléculas orgânicas, conhecidas como coenzimas, que frequentemente são derivdas de vitaminas.

- Regulação: a atividade enzimática pode ser regulada, isto é, as enzimas podem ser atividas ou inibidas, demodo que a velocidade de formação do produto responda as necessidades da célula.

- Localização dentro da célula: muitas enzimas estão localizadas em organelas específicas dentro da célula. Esta compartimentalização serve para isolar o substrato ou o produto da reação de outras reações competitivas. Isso garante o meio favorável para a reação e organiza as milhares de enzimas presentes na célula em vias definidas.

Velocidade de reação

Reação catalizada por enzima: coloca a enzima e espera um tempo. A enzima atua sobre o substrato e então tenho o produto.
A velocidade das reações catalisadas por enzimas podem ser afetadas pelos seguintes fatores:

1 - Temperatura

A medida que a temperatura aumenta, a velocidade da reação aumentou até um valor máximo (temperatura ótima) de funcionamento da enzima. O aumento da temperatura aumenta a energia cinética das moléculas, aumenta o número de colisões --> aumento de P (produto) formado.

Já o aumento da temperatura, além da temperatura ótima, causa desnaturação crescente da enzima --> com crescente perda da atividade.

No caso dos seres humanos, a temperatura ótima é de 37 graus C. Até 37 graus C os números de produtos aumentam. Depois de 37 graus C diminui.


2 - pH

Extremos de pH causam desnaturação das maiorias das proteínas e proteínas desnaturadas perde com a atividade. pH muito ácidos ou muito básicos causam desnaturação.

Pepsina e Tripsina são enzimas proleolíticas e é, enzima que quebram ligações peptídicas. Estão envolvidas na digestão das proteínas.
pH ótimo da pepsina: 1,5 e 2,0
pH ótimo da tripsina: 7,0 e 8,0

3 - Concentração de substrato

Em 1913 Michaelis - Mentem:
- colocou todas as enzimas em banho maria há 25 graus C
- dissolveu o substrato no ph ótimo da enzima
- fixou a tempera e o pH
- colocou a enzima (10 micro litros)
- a concentração da enzima também ficou fixa
- apenas o substrato não é fixo
- esperou-se 20 minutos
- determinou quanto de produto (P) foi formado em cada tubo

Observou-se um gráfico com curva hipérbole para velocidade versus substrato onde, em baixas concentrações de substrato, a velocidade é proporcional a concetração de substrato. Em altas concentrações de substrato, a velocidade permanece constante e foi determinada vmax (velocidade máxima).

A enzima obrigatoriamente tem que ligar no substrato através de ligações iônicas, covalentes, ponte de hidrogênio, hidrofóbica para ter produtos. Aí depois a enzima fica livre.

Tem que ter uma química (afinidade) entre a enzima e o substrato.
Lembrar do exemplo de casamento em sala de aula - que pode ou não ocorrer.

4 enzimas e 8 substratos --->1 ES ---> P
4 enzimas e 16 substratos --->2 ES ---> 2 P (a velocidade aumenta)
4 enzimas e 24 substratos ---> 3 ES ---> 3 P
4 enzimas e 32 substratos --->4 ES ---> 4P
4 enzimas e 40 substratos --->4 ES ---> 4P (quando a quantidade de substratos é muito grande estabiliza o número de produtos)

Para cada enzima existe uma concentração de substrato (S) que leva a formação de 100% de ES e quando há formação de 100% de ES é a velocidade máxima (vmax).

No exemplo dado, não adianta ter mais substrato se somente tenho 4 enzimas. Neste caso, como já formaram 4 ES, tanto faz ter 32, 40 ou 48 substratos.

Em altas concentrações de substrato, a velocidade da reação é constante e independente da concentração de substrato.

Em baixas concentrações de substrato, a velocidade da reação é proporcional a concentração de substrato.


Qual é a afinidade de cada enzima pelo substrato?

A determinação da quantidade de substrato necessário para formar 50% de ES da idéia da afinidade da enzima pelo substrato. Quanto menor a quantidade de S necessária para formar 50% de ES, maior é a afinidade.

A (S) concentração de substrato que fornece uma velocidade de reação = vmax/2 é a quantidade de afinidade. Essa constante de afinidade foi denominada Km. Km é (S) é dada em moles ou mmoles/l.

Km é a concentração do substrato necessária para formar 50% de ES. Quanto menor o Km maior a afinidade.



A velocidade depende da enzima e do substrato

Velocidade = vmax (medida de concentração)
|
que (S) é essa? é a S suficiente para formar 100% de ES

A vmax é quando tem 100% de ES.

V = vmax (nesse ponto tenho 100% de ES)

Qual a concentração de substrato que dá 50%?

(S) --->100% ES ---> V = vmax
(S) ---> 50% ES ---> v=vmax / 2


KM = CONSTANTE DE MICHAELIS

Existe uma concentração de substrato que dá velocidade máxima
Existe uma concentração de substrato que dá 50% de velocidade máxima.

Constante de Michaelis-Menten (Km) = concentração de substrato na qual a velocidade inicial da reação é igual à metade de sua velocidade máxima.

V0 = Vmax (S)
-----------
Km + (S)


CONSTANTE DE AFINIDADE = 50% de ES


Observações:

Quando comemos carboidrato, ela é digerida e transformada em glicose. A glicose sai do intestino, entra no sangue (veia porta) e cai no fígado. Principal produto do carboidrato = glicose.
Quando a glicose entra no fígado ela tem que sofrer reação para se transformar em glic6P (glicose 6 fosfato).
A que não é transformada em glic6P volta para o sangue e espalha pelo corpo. Chegando em outras células por exemplo no cérebro, transformando-se novamente em glic6P.
Se ela não se transformar em glic6P somente ficará passeando pelo corpo. Se ela se transformasse totalmente em glic6P ficaria apenas num lugar, pro exemplo fígado.



Hexoquinase

Coloca o fosfato.
A enzima que faz a reação de transformar glicose em glic6P tem Km baixo, ou seja, grande afinidade. E essa enzima usa os 100% e dispensa o restante.
Se a pessoa come muito carboidrato, as células pegam os 100% e o restante da glicose fica no sangue. Volta novamente para o fígado. Aí nesse momento aparece outra a GLICOQUINASE. Essa enzima já faz muito mais reação (usa muito mais glicose) do que a outra.
Seu Km é alto = pouca afinidade.

Depois que a glicoquinase pega toda a glicose, vira gordura, TG (triglicérides) e depois a gordura vai para o tecido adiposo.

No cérebro somente tem a hexoquinase:
glic
| hexoquinase
glic6P
| energia (ATP 38) quando o ATP fica alto inibe a enzima.
6CO2


INIBIDORES
Qualquer substância que possa diminuir a velocidade de uma reação catalisada por uma enzima é chamado de inibidor.

Os inibidores regulam a atividade da enzima. É uma substância que pode diminuir a capacidade de uma reação de uma enzima.

Os inibidores podem ser irreversíveis e reversíveis (não competitivo e competitivo):


INIBIDORES REVERSÍVEIS: ligam-se à enzima por meio de ligações não covalentes.
Competitivos
Não competitivos
No caso do inibidor reversível liga e pode desligar. E + I --> E . I
No caso do inibidor irreversível, perde-se a enzima porque não vai reagir. E + I --> E - I

A velocidade é proporcional a quantidade de ES.


Inibidor Não Competitivo

Esse tipo de inibição pode ser reconhecido por seu efeito característico sobre Vmax. A inibição não-competitiva acontece quando o inibidor e o substrato ligam-se a sítios diferentes sobre a enzima. O inibidor não-competitivo pode ligar-se tanto a enzima livre quanto ao complexo de ES, de modo a impedir que a reação ocorra.

1 - Efeito sobre a Vmax: a inibição não-competitiva não pode ser superada pelo aumento da concentração de substrato. Desse modo, os inibidores não-competitivos diminuem a Vmax da reação.

2 - Efeito sobre o Km: os inibidores não-competitivos não interferem na ligação do substrato com a enzima. Assim sendo, a enzima mostra o mesmo Km na presença e na ausência do inibidor não-competitivo.

Não parecem com o substrato. Mas eles tem especificidade. Ele se liga em outro local da enzima provocando mudança no sítio ativo.

Atrapalha o substrato a se ligar no sítio ativo.

O inibidor se liga na enzima.

Em geral se ligam em outro local da enzima (sem ser no sítio ativo) e são tóxicos.

Inibidor Competitivo

Esse tipo de inibição ocorre quando o inibidor liga-se reversivelmente ao mesmo sítio que o substrato normalmente ocuparia e, dessa forma, compete com o substrato por esse sítio. 

É uma substância semelhante com o substrato e pode se ligar no mesmo local que o substrato se ligaria na enzima. É uma molécula. Liga-se ao sítio ativo da enzima formando um complexo EI que não dá produto. Não há alteração na vmax.
Se ligou durante um tempo atrapalhando a enzima a formar produtos.
Ex: infecções bacterianas

A enzima continua ligando no substrato mas não consegue gerar produtos. Ela liga no sítio ativo mas não transforma em produto. Se o inibidor liga-se no sítio ativo, o substrato não consegue ligar. Ele muda a estrutura do sítio ativo e por isso não transforma o produto. O inibidor pode se ligar antes ou depois do substrato se ligar com a enzima. Exemplo: o chumbo; o chumbo impede a ligação do ferro. Ou seja, a enzima que cataliza a inserção do ferro é inibido pelo chumbo.

Substâncias semelhantes ao substrato podem enganar a enzima ligando-se ao seu sítio ativo, formando um complexo EI que não dá produto.

A quantidade de produto depende de ES.
1 ES --> X Produtos
2 ES --> X2 Produtos

O inibidor competiu com a enzima pela ligação no sítio ativo.

Um inibidor competitivo aumenta o Km aparente para determinado substrato. Isso significa que, na presença do inibidor, mais substrato é necessário para atingir ½ Vmax.

1 - Efeito sobre a Vmax: o efeito de um inibidor competitivo é revertido pelo aumento da (S). Em uma concentração de substrato suficientemente alta, a velocidade da reação atinge a Vmax observada na ausência do inibidor.

2 - Efeito sobre a Km: um inibidor competitivo aumenta o Km aparente para determinado substrato. Isso significa que, na presença de um inibidor competitivo, mais substrato é necessário para atingir 1/2 ou 50% da Vmax.

Experiência para diagnosticar o tipo de inibição:

Se a velocidade for a mesma, o inibidor é competitivo.
Se a velocidade for diferente, o inibidor é não-competitivo.



COFATORES

 São as auxiliares das enzimas.
Os cofatores são: íons metálicos, moléculas orgânicas (não protéicas - coenzimas) e micronutrieentes.

A molécula orgânica não protéica são geralmente as vitaminas ou molécula que contém vitamina na sua estrutura.

Sais mineirais e vitaminas (micronutrientes)

Carboidrato, lipídeos e proteínas (macronutrientes)
Quando a enzima está associada a um íon metálico ou molécula orgânica não protéica é porque ela depende de um auxiliar.


Vitamina

Vita amina = amina vital
A primeira vitamina isolada, a B1 é uma amina. Quando descoberta verificaram que ela devia estar presente na dieta para a preservação da vida normal.

Vitaminas ou moléculas orgânica contendo vitamina na sua estrutura responsável por auxiliar uma enzima é denominada COENZIMA.
Exemplos de Vitaminas:

1) Biotina (dieta)
nas células, se associa a enzimas responsáveis pela adição de CO2.

2) Tianina (dieta)
se associa às enzimas que removem grupo CO2 de alguns ácidos.

3) Nicotinamida
auxilia as enzimas que catalizam a remoção de H e eletrons de um substrato

O álcool inibe a absorção da tiamina (vitamina B1). A tiamina é importante para degradar a glicose do cérebro. Fontes: carnes, gema de ovo e cereal integral.
Timina (vitamina)
Tiamina Pirofosfato (forma coenzimática)

Riboflavina: importante para as hemácias. Fontes: leites e seus derivados.

Niacina: metabolismo de carboidrato, glicose. Fontes: carnes, legumes e etc.


ZINOGÊNIOS

Pâncreas: suco pancreático (mistura das enzimas digestivas). Entre essas enzimas, as enzimas proleolíticas que o pâncreas tem que produzir.

Enzimas proleolíticas: esse suco deve ser liberado no duodeno, onde ocorre a proteólise das proteínas da dieta (digestão da proteína).

Por que, geralmente, essas enzimas proleolíticas não catalisam a proteólise das proteínas pancreáticas?
O pâncreas produz enzimas, numa forma praticamente inativa, e somente no .................... elas são transformadas numa forma ativa.

Uma enzima proleolítica inativa é denominada zimogênio, pró-enzima ou pré-enzima.

Na pancreatite, esses zimogênios, são precocentemente ativados no pâncreas --> auto digestão.

Zimogênio --------------------------------------> enzima ativa
luz na sua (enzima conversora)
forma inativa


Pâncreas produz tripsinogênio (zimogênio, enzima inativa), que no duodeno é convertido em tripsina (enzima ativa).

Por que os alveolos não são destruídos normalmente? Devido a presença de um inibidor de enzima proleolíticas. Esse inibidor é a alfa um antitripsina.

1) Enzima pulmonar devido a incapacidade de produzir esse inibidor (defeito genético).
elastina -------------------> não há formação de P (elastina não é destruída).
(elastase)

2) Fumantes podem desenvolver enfizema pulmonar. A nicotina leva a modificação na estrutura da alfa um antitripsina, diminuindo sua capacidade de inibição da elastase.

ENZIMAS ALOSTÉRICAS

São compostas por múltiplas subunidades; Catalisam reações limitantes de velocidade; ligam o substrato cooperativamente; apresentam uma curva sigmoidal quando se constrói um gravo de v x s.

Ocorre nas enzimas que possuem um SÍTIO ALOSTÉRICO, onde se liga de forma não-covalente um modulador alostérico que pode ser positivo (ativa a enzima) ou negativo (inibe a enzima).

A ligação do modulador induz a modificações conformacionais na estrutura espacial da enzima, modificando a afinidade dessa para seus substratos.

Já estudamos enzimas em que o efeito da (S) versus velocidade (V) é uma hipérbole:
V x S --> hipérbole, enzima que segue a cinética de Michaelis Menten: a maioria das enzimas.

Algumas enzimas V versus S origina uma sigmóide (enzima alostérica)

Enzima Michaelianas: proteínas globulares constituídos de uma única cadeia polipeptídica.

Enzima Alostéricas: proteínas globulares, constituídos de pelo menos 2 cadeias polipeptídicas, associadas através de ligações não covalentes (estrutura quartenária).

As enzimas alostéricas são reguladas por moléculas chamadas de efetores (também modificadores), que ligam-se de forma não-covalente em outro sítio, que nao o sítio ativo.

Uma subunidade contém o sítio ativo e é denominado de subunidade catalítica e as outras subunidades contém outros sítios diferentes S do sítio ativo, pois não são capazes de originar P.

Substâncias que ligam no sítio alostérico são denominados efetores ou moduladores alostéricos.


Os níveis plasmáticos de creatina cinase (CK) são comumente determinados para o diagnóstico do infarto do miocárdio.

O músculo cardíaco é o único tecido que contém mais de 5% da atividade total de CK como CK2 (MB).

O aparecimento dessa isoenzima híbrida no plasma é praticamente específico para o infarto do miocárdio.

Os efetores que inibem a atividade enzimática são denominados efetores negativos, enquanto aqueles que aumentam a atividade enzimática são denominados efetores positivos. Um efetor alostérico pode alterar a afinidade da enzima pelo seu substrato ou modificar a atividade catalítica máxima da enzima ou ambos.


Essas enzimas tem mais de uma cadeia e cada cadeia é denominada SUBUNIDADE.

Uma subunidade contém o sítio ativo e é denominada de subunidade catalítica e as outras subunidades contém outros sítios diferentes S do sítio ativo, pois são capazes de originar P.


DOENÇAS
Muitas doenças que causam lesão tecidual resultam no aumento da liberação das enzimas intracelulares no plasma.

As atividades de muitas dessas enzimas são rotineiramente determinadas para fins de diagnóstico em doenças do coração, do fígado e músculo esqueléticos.

Algumas enzimas apresentam atividade relativamente alta em apenas alguns tecidos. Assim, a presença de um aumento do nível dessas enzimas no plasma reflete uma lesão do referido tecido.


DOENÇA CARDÍACA

Após um infarto agudo do miocárdio, essa isoenzima aparece cerca de 4 a 8 horas depois do início da dor torácica e atinge um pico de atividade em aproximadamente 24 horas.



Referências Bibliográficas:



CHAMPE, Pamela C.; HARVEY, Richard A.; FERRIER, Denise R. Bioquímica Ilustrada. 3 ed. Porto Alegre: Artmed, 2006.


MARZZOCO, Anita; TORRES, Bayardo B. Bioquímica Básica. 3 ed. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan S.A., 2007.